Micro-CT com contraste para avaliar a desbridagem do tecido pulpar em canais radiculares de dentes extraídos: uma série de experimentos em cascata para validação do método

Resumo

Objetivo: Validar um novo método para a avaliação da desbridagem do tecido pulpar nos canais radiculares de dentes extraídos utilizando um protocolo de impregnação envolvendo triiodeto de potássio, uma solução radiocontraste conhecida como solução de Lugol, combinada com imagem de microtomografia computadorizada (micro-CT).

Metodologia: O impacto do NaOCl na radiopacidade da solução de Lugol foi avaliado utilizando uma série de diluições em duas etapas de Lugol em água destilada e NaOCl a 5,25%, que foram então pipetadas em pratos transparentes e radiografadas. Para verificar a influência do Lugol no efeito proteolítico do NaOCl, um teste de dissolução foi realizado utilizando carne bovina fresca. Dez fatias não passaram por nenhum processamento de tecido, enquanto vinte fatias foram fixadas em formaldeído por 24 h. Após isso, 10 delas foram imersas em Lugol por mais 24 h. Em seguida, todos os espécimes foram colocados em NaOCl e o tempo necessário para uma dissolução completa do tecido foi registrado. Para os últimos experimentos (validação histológica e avaliação por micro-CT), 8 pré-molares mandibulares extraídos com polpas anteriormente vitais foram imersos em formalina tamponada, escaneados em um dispositivo de micro-CT, acessados, imersos em Lugol por 7 dias e escaneados novamente. Então, os canais radiculares de 5 dentes foram preparados e escaneados, e o volume do tecido pulpar remanescente identificado e quantificado, enquanto 3 dentes foram processados histologicamente. Os mesmos espécimes foram submetidos à avaliação histológica, e as imagens das seções histológicas foram registradas com as correspondentes imagens de micro-CT para verificar se o tecido pulpar nas seções histológicas correspondia ao seu equivalente nos tecidos impregnados com Lugol identificados nas fatias de micro-CT.

Resultados: Não houve efeito discernível na radiopacidade quando NaOCl foi misturado com a solução de Lugol. O processamento do tecido não afetou o tempo necessário para a dissolução completa da carne bovina fresca. A avaliação histológica revelou uma correlação entre micro-CT e imagens histológicas confirmando a identificação do tecido pulpar impregnado com Lugol nas imagens de micro-CT. Conclusões: A solução radiocontraste de Lugol não foi afetada pelo NaOCl e não interferiu em sua capacidade de dissolução de tecidos moles. O protocolo de impregnação utilizando a solução de Lugol permitiu a visualização do tecido pulpar nas imagens de micro-CT e a identificação de restos pulpares após procedimentos químicos-mecânicos de canal.

Introdução

A análise convencional de seções histológicas e o uso de tomografia computadorizada por micro-raios-X (micro-CT) são considerados os métodos padrão-ouro para avaliar procedimentos de limpeza e modelagem durante a preparação do canal radicular. Enquanto o micro-CT permite a identificação e quantificação dos tecidos mineralizados do canal radicular removidos pela preparação mecânica, a quantidade de tecido pulpar restante (não mineralizado) é geralmente avaliada em seções histológicas. Assim, apesar da utilidade da tecnologia micro-CT, este método tem sido limitado à avaliação de mudanças ao longo das paredes do canal, incluindo transporte e a criação de aberrações, como zíperes e perfurações. Devido ao poder de penetração dos raios-X, as técnicas de micro-CT fornecem um mapa de densidade 3D de espécimes e tecidos que absorvem fortemente essa radiação (Alfaro et al. 2015, Cunha et al. 2015). No entanto, não é adequado para a imagem de tecidos moles, como a polpa dental, uma vez que esses tecidos absorvem raios-X em um grau muito limitado (Gignac & Kley 2014).

Recentemente, uma abordagem correlativa utilizando histologia como um método complementar para avaliação de micro-CT foi empregada em dois estudos para avaliar vários protocolos quimomecânicos em canais radiculares (Lacerda et al. 2017, Siqueira et al. 2018). Ambos os estudos demonstraram histologicamente a presença de restos de tecido pulpar aderidos às paredes do canal não tocadas, previamente identificadas pela análise de micro-CT. Embora essa abordagem correlativa utilizando diferentes métodos possa permitir a atribuição de mecanismos de causalidade, a análise histológica geralmente permite apenas algumas seções por raiz a serem avaliadas, o que fornece dados muito limitados e é inconsistente com a quantidade de informações em centenas de imagens seccionais geralmente produzidas pela varredura de micro-CT de um canal radicular típico. Além disso, a seção histológica é um procedimento demorado e caro que destrói o espécime.

É obviamente desejável desenvolver um método experimental não destrutivo confiável capaz de avaliar simultaneamente a qualidade e a quantidade de tecidos moles e duros em um espécime heterogêneo, como o dente humano. Em outras áreas de pesquisa, essa limitação foi superada pelo uso de vários agentes de contraste, como ósmio, ouro, sulfato de bário e corantes à base de iodo (Metscher 2009a, b, Faulwetter et al. 2013, Pauwels et al. 2013). De modo geral, foi demonstrado que uma solução aquosa de iodo de Lugol, também chamada de iodeto de potássio de iodo (I₂KI), está entre os meios mais eficazes para diferenciar rapidamente uma diversidade de tipos de tecidos moles. A solução de Lugol é uma opção de coloração simples, econômica, não tóxica e rápida para o aumento de contraste de tecidos moles. No entanto, seu uso foi limitado a estudos anatômicos de uma ampla variedade de espécimes biológicos utilizando uma ampla gama de diferentes concentrações de iodo e durações de coloração, dependendo do tipo de tecido (Heimel et al. 2019). Atualmente, apesar do fato de que a impregnação de Lugol é o agente de contraste mais amplamente utilizado no estudo anatômico de tecidos moles, ainda não está claro se essa solução seria adequada na avaliação de micro-CT de tecido pulpar após a desinfecção do canal radicular ex vivo. Uma das questões fundamentais ao usar Lugol diz respeito ao hipoclorito de sódio (NaOCl), o principal irrigante endodôntico usado para dissolver tecido pulpar necrótico (Zehnder 2006), que reage com o iodo (Vogel 1978) e poderia, assim, interferir em sua impregnação e visibilidade em imagens radiográficas.

A presente comunicação relata uma série de experimentos em cascata que buscam introduzir e explorar o potencial de visualizar o tecido pulpar dental em imagens de micro-CT usando Lugol como uma solução de contraste. A cascata de experimentos teve como objetivo validar o protocolo de impregnação e o método de micro-CT com contraste aprimorado (CE-CT), enquanto identificava as vantagens e potenciais limitações dessa nova metodologia. Os experimentos em cascata foram projetados para:

• Avaliar o potencial do NaOCl para reduzir o grau de contraste radiográfico associado ao Lugol (teste de radiopacidade);
• Verificar a possibilidade de que a solução de Lugol afete o efeito proteolítico do NaOCl (teste de dissolução de tecidos moles);
• Avaliar a capacidade da solução de Lugol de impregnar adequadamente o tecido pulpar por meio de imagens correlativas de micro-CT aprimorado com Lugol e histologia convencional (validação histológica);
• Medir o volume restante de tecido pulpar impregnado com Lugol (avaliação volumétrica de micro-CT).

Materiais e métodos

Impacto do NaOCl na radiopacidade da solução de Lugol

A solução de Lugol (I₂KI) utilizada para todos os experimentos tinha uma concentração de 5% I₂ e 10% KI. Para avaliar o impacto do NaOCl em sua radiopacidade, foi realizada uma série de diluições 1:1 em água destilada e NaOCl 5,25% (1,5 mL de volume total). A solução pura e suas diluições foram pipetadas em pratos redondos transparentes de poliestireno (Semadeni, Ostermundigen, Suíça) com um diâmetro interno de 23,4 mm e profundidade de 3,5 mm. A radiopacidade foi determinada usando um conjunto padrão conforme descrito anteriormente (Hertig et al. 2017). Em resumo, conjuntos de dados eletrônicos foram gerados usando uma unidade fixa (Trophy, Paris, França) a 65 kV, 8 mA e 0,22 s com uma distância foco-filme de 25 cm e sensores eletrônicos (Digora; Soredex, Tuusula, Finlândia). As imagens foram analisadas usando o ImageJ (Bethesda, MD, EUA). Os valores de cinza foram normalizados em cada imagem em relação a um degrau de alumínio, com uma curva padrão individual para cada imagem. Os experimentos foram realizados em triplicatas. A radiopacidade relativa da solução de Lugol e suas diluições é expressa como o equivalente de alumínio (em mm) por mm de solução.

Teste de dissolução de tecido mole

Trinta fatias de carne bovina fresca foram ajustadas para um peso semelhante (2 mg) e dimensões (4 x 4 mm) usando uma lâmina cirúrgica nº 15. Dez fatias não passaram por nenhum processamento de tecido, enquanto as outras 20 foram fixadas em formol por 24 h. Após isso, 10 das fatias fixadas foram imersas em solução de Lugol por mais 24 h. Em seguida, todos os espécimes foram colocados individualmente em frascos contendo 40 mL de NaOCl a 5,25% e o tempo total necessário para a completa dissolução do tecido pulpar (em min) foi registrado. Todos os procedimentos de teste foram realizados à temperatura ambiente. Esta investigação não foi classificada como um estudo com animais porque não teve influência no destino premortal ou no processo de abate dos animais. A análise preliminar dos dados brutos indicou a aderência a uma distribuição gaussiana (teste de Shapiro–Wilk, P < 0,05). Os dados foram comparados entre os grupos usando ANOVA de uma via seguida pelo teste HSD de Tukey. O erro alfa foi considerado em 5%.

Avaliação de micro-CT de restos de tecido pulpar

Após a aprovação pelo comitê de ética local (protocolo nº 12127319.3.0000.5243), oito pré-molares mandibulares de raiz única não cariados e um molar mandibular com polpas vitais, extraídos por razões ortodônticas, foram imersos em formalina tamponada a 10% e armazenados por até 30 dias a 15 °C. Em seguida, os dentes foram escaneados com um tamanho de pixel de 14,37 lm usando um dispositivo de micro-CT (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Bélgica) configurado para 70 kV, 114 mA, rotação de 360° em torno do eixo vertical com um passo de rotação de 0,5°, média de quadro de 5, usando um filtro de alumínio de 1,0 mm de espessura. O software NRecon v.1.7.16 (Bruker micro-CT) foi utilizado para reconstruir as projeções de micro-CT em seções transversais axiais usando uma correção de artefato de anel de 4, limites de contraste variando de 0,006 a 0,05 e correção de endurecimento do feixe de 40%, resultando em 800–900 imagens em escala de cinza por dente, desde a junção cemento-esmalte até o ápice. Para verificar a morfologia do canal, as imagens transversais foram segmentadas usando uma rotina automática (De-Deus et al. 2020) no software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Madison, WI, EUA), e a razão de aspecto do canal radicular, definida como a razão entre os diâmetros maior e menor, foi medida em cada fatia desde o orifício até o forame apical. Em seguida, o volume do canal (em mm³) foi calculado como o volume do canal radicular binarizado dentro do volume de interesse.

Após a preparação da cavidade de acesso convencional, cada dente foi imerso em solução de Lugol por 7 dias e submetido a um novo escaneamento e procedimentos de reconstrução utilizando os parâmetros mencionados anteriormente, a fim de avaliar a impregnação de todo o tecido pulpar pela solução de contraste. Este conjunto de imagens foi coregistrado com o conjunto de dados não corados usando o algoritmo afim implementado no software 3D Slicer 4.6.0 (http://www.slicer.org) (Fedorov et al. 2012), e a dentina radicular do dente após a imersão foi removida através de uma operação booleana para reduzir o ruído gerado pela segmentação do tecido pulpar. Assim, o tecido pulpar impregnado com a solução de Lugol foi observado e quantificado (em mm³) pelo processo de segmentação com um valor de limiar específico, utilizando a ferramenta Object Counter disponível no software FIJI/ImageJ. Após isso, os canais radiculares de 5 dos 8 premolares selecionados foram preparados quimicamente e mecanicamente, enquanto os outros 4 dentes sadios (3 premolares e 1 molar) foram preparados para seccionamento histológico para confirmar a presença dos restos do tecido pulpar (grupo controle).

Preparação do canal radicular

Os canais radiculares foram preparados até o comprimento de trabalho com o instrumento Reciproc R25 (VDW GmbH, Munique, Alemanha) acionado por um motor VDW Silver (VDW GmbH) no programa pré-definido ‘RECIPROC ALL’, utilizando pressão apical leve com um movimento de picote lento de entrada e saída de 3 mm de amplitude. Após completar três movimentos de picote, o instrumento foi removido do canal e suas flautas limpas por inserção em uma esponja umedecida com álcool. O comprimento de trabalho foi alcançado após 3 ondas de instrumentação. A patência apical foi realizada com uma K-file tamanho 15 (Dentsply Sirona Endodontics, Ballaigues, Suíça) durante todo o procedimento de preparação. A irrigação foi realizada com um total de 12 mL de NaOCl 5,25% dispensados no canal radicular com uma agulha de porta dupla 31-G NaviTip (Ultradent Inc., South Jordan, UT, EUA) inserida até 1 mm abaixo do comprimento de trabalho durante todo o procedimento de preparação. Após a preparação do canal radicular, as amostras foram reescaneadas, reconstruídas e co-registradas usando os parâmetros mencionados. Em seguida, o volume de restos de tecido pulpar impregnados com solução de Lugol foi calculado (em mm³) e quantificado como um valor percentual com base no volume inicial do tecido pulpar.

Avaliação histológica

Após os procedimentos experimentais descritos acima, os espécimes foram desmineralizados em uma solução de ácido fórmico a 22,5% (vol/vol) mais 10% (peso/vol) de citrato de sódio por um período de 2 a 3 semanas. O ponto final foi monitorado radiograficamente. Os espécimes foram então enxaguados por 24 h em água da torneira, desidratados e processados para exame histológico rotineiro. Os dentes foram embebidos em blocos de parafina, e cortes transversais de 0,6 µm de espessura foram obtidos a cada 1 mm da junção cemento-esmalte até o ápice, resultando em 8 fatias por dente. As seções adquiridas foram montadas em lâminas de vidro e coradas com hematoxilina-eosina. As imagens histológicas foram visualizadas usando um microscópio de luz totalmente motorizado Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision, Hallbergmoos, Alemanha).

Correspondência entre as imagens de micro-CT impregnadas com Lugol e as fatias histológicas

As fatias de micro-CT adquiridas contendo o tecido pulpar impregnado com Lugol foram inspecionadas ao longo do eixo z usando um sistema de coordenadas de referência baseado em um algoritmo de registro baseado em marcos (software Analyze; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, EUA) para alinhá-las com as imagens de micro-radiografia das seções histológicas. Após selecionar as imagens correspondentes, um ajuste de padronização dimensional foi realizado, incluindo ampliação automática, redimensionamento e recorte, por meio de um procedimento assistido por computador. Esta etapa do procedimento permitiu que os examinadores inspecionassem de forma confiável as raízes nos mesmos níveis e, assim, verificassem qualitativamente se o tecido pulpar na seção histológica correspondia ao seu equivalente na fatia de micro-CT impregnada com Lugol, confirmando a eficácia do protocolo de impregnação e dos parâmetros de digitalização. Dois examinadores pré-calibrados utilizaram um proforma com critérios pré-definidos para analisar o grau de correspondência entre as imagens impregnadas com Lugol e as histológicas. O procedimento de análise de imagem foi realizado em um monitor de computador de alta qualidade de 34’ com a possibilidade de ampliar as imagens (até 10x) e inverter o modo de cor. Para validar o processo analítico, as análises foram repetidas duas vezes em intervalos de 10 dias para avaliar a reprodutibilidade.

Resultados

Impacto do NaOCl na radiopacidade da solução de Lugol

A solução pura de Lugol teve uma radiopacidade de 0,70 ± 0,09 mm Al mm^-1. A diluição em 5,25% de NaOCl teve um efeito semelhante na radiopacidade em comparação com o procedimento controle em água, com as diluições mais altas em NaOCl mostrando uma radiopacidade ligeiramente maior (Fig. 1), que é baseada na diferença de radiopacidade entre a solução pura de 5,25% de NaOCl e água de 0,05 mm Al mm^-1. Não houve efeito discernível na radiopacidade causado pela interação química entre o NaOCl e a solução de Lugol, que foi visível pela descoloração do tom marrom na presença de NaOCl.

Teste de dissolução de tecidos moles

Os gráficos de violino ilustram os valores médios, mínimos e máximos, bem como a distribuição dos dados da dissolução do tecido entre os espécimes (Fig. 2). O processamento do tecido em formaldeído e solução de Lugol não afetou o tempo necessário para a dissolução da carne bovina fresca (P > 0,05).

Validação histológica

A qualidade geral do protocolo de coloração utilizado é ilustrada na Figura 3. A análise correlativa entre micro-CT e imagens histológicas confirmou a identidade do tecido pulpar impregnado com Lugol nas imagens de micro-CT. Os resultados das imagens de micro-CT e histológicas correspondentes são mostrados nas Figuras 4 e 5, confirmando a qualidade do protocolo de coloração.

Avaliação volumétrica de micro-CT

Além disso, os restos de polpa segmentados após a preparação do canal radicular foram quantificados e expressos como um valor percentual. O volume do canal radicular instrumentado e as áreas de canal não instrumentadas adquiridas pelo método de micro-CT também foram quantificados (Tabela 1) e ilustrados nas Figuras 6 e 7 e no Vídeo Suplementar 1. O volume do canal radicular e a razão de aspecto influenciaram diretamente a remoção do tecido pulpar durante a instrumentação. Dentes com valores de razão de aspecto inferiores a 3,5, expressos pela curva gráfica e altos volumes, estavam associados a volumes menores de restos de tecido pulpar.

Discussão

Esta comunicação apresenta um novo método de coloração para tecido pulpar dental no contexto da avaliação de micro-CT da desinfecção do canal radicular, com usos benéficos óbvios para futuras pesquisas nesta área. O método proposto, não destrutivo, é capaz de fornecer imagens de alta resolução e informações 3D sobre o tecido pulpar e a dentina simultaneamente, permitindo assim a avaliação longitudinal e volumétrica quantitativa dos procedimentos de limpeza e modelagem do canal radicular. Desde que Gysi & Röse (1894) publicaram as primeiras fotomicrografias de alta qualidade retratando detalhes dos elementos vasculares, linfáticos e nervosos do complexo pulpar-dentinário de um molar mandibular, e Kölliker (1852) forneceu a primeira descrição da polpa dental, nomeada por ele como Pulpa dentis, em seu livro clássico sobre as estruturas minuciosas dos tecidos e órgãos do corpo, muitos estudos investigaram dentes utilizando métodos histológicos. Usando essa técnica, Hatton et al. (1928) foram os primeiros a demonstrar que o canal foi apenas limpo superficialmente e que grande parte do tecido pulpar não foi removido após a preparação com instrumentos de aço inoxidável. No entanto, foi somente após Walton (1976) publicar um estudo seminal avaliando a quantidade de tecido pulpar remanescente após os procedimentos de limpeza e modelagem que a seção histológica baseada em parafina se tornou o método padrão para determinar a eficácia dos procedimentos de desinfecção dentro do espaço do canal radicular.

Em dentes intactos com polpas vitais, normalmente usados como controle em estudos de seccionamento histológico, o tecido pulpar está anexado a todo o perímetro do canal radicular (De-Deus et al. 2010, 2011), enquanto os restos de tecido nos grupos experimentais confirmam quais áreas ao longo das paredes do canal não foram desbravadas mecanicamente ou onde os protocolos de irrigação foram ineficazes. Uma vez que os restos de polpa podem servir como um substrato para bactérias e poderiam afetar negativamente a qualidade dos procedimentos de preenchimento do canal (Ricucci et al. 2009, Ricucci & Siqueira 2011), isso teoricamente endossa esta variável experimental, o tecido pulpar remanescente, como um ponto final substituto aceito para a qualidade dos procedimentos de desbridamento dentro do espaço do canal radicular. No entanto, os processos e a carga de trabalho resultante para a preparação de espécimes que envolvem seccionamento, coloração, imagem e a avaliação histológica final abrangente permanecem como uma técnica trabalhosa e intensiva em mão de obra. Especificamente, no contexto da pesquisa laboratorial endodôntica, a desmineralização de tecidos dentais mineralizados é uma etapa demorada e complicada e é desafiador alcançar espécimes de alta qualidade sem danificar o tecido pulpar. Isso se torna ainda mais importante, uma vez que, em geral, o seccionamento histológico de tecidos duros desmineralizados tende a induzir consideráveis distorções teciduais, falhas de processamento e artefatos estruturais. Por exemplo, o encolhimento do tecido de até 3% ocorre com tecidos ósseos (Lane & Ráliš 1983, Henson et al. 1994), enquanto a desidratação de tecidos moles pode criar encolhimento de até 11% (Rown et al. 2002). Assim, mesmo com as percepções úteis disponíveis na literatura sobre este tópico, é importante notar que os dados de microscopia quantitativa do seccionamento histológico foram derivados de tecidos que presumivelmente encolheram durante a preparação do espécime. Além disso, as técnicas de seccionamento histológico invariavelmente levam à perda de espécimes, tornando experimentos longitudinais ao longo do tempo impossíveis. Portanto, a histologia pode ser considerada um método arcaico em comparação com a abordagem volumétrica e quantitativa alcançada por métodos de imagem não destrutivos (Tabela 2), embora até hoje permaneça o único modelo experimental disponível que permite a avaliação simultânea de tecidos duros mineralizados e moles dos dentes em seu nível ultraestrutural e, consequentemente, é capaz de lançar luz sobre esta importante área de pesquisa (De-Deus et al. 2008, 2010, 2011).

Vários estudos utilizando tecnologia de micro-CT não destrutiva demonstraram que a preparação das paredes do canal radicular por instrumentos endodônticos ativados em movimento rotativo ou reciprocante não é ideal (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018).

A preparação mecânica com esses instrumentos é limitada, pois tendem a preparar apenas os aspectos centrais dos canais radiculares para criar uma forma arredondada, deixando a maior parte das extensões bucal e lingual desses espaços complexos intocados, mesmo ao tentar movimentos laterais, como ao usar um movimento de escovação (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018).

Embora o micro-CT possa fornecer medições valiosas e precisas sobre a posição e a quantidade de dentina removida durante a preparação do canal, ele não fornece informações sobre o tecido pulpar ou biofilmes microbianos que podem permanecer aderidos às paredes do canal radicular, particularmente em áreas não alcançadas pela ação mecânica dos instrumentos, como istmos, lâminas, anastomoses e canais acessórios (Versiani et al. 2013). Isso significa que o micro-CT tem sido essencialmente limitado à avaliação das mudanças nas paredes dentinárias, uma vez que, em sua essência, o micro-CT não é adequado para imagem de tecidos moles, pois são virtualmente 'transparentes' para raios-X. Essa limitação está relacionada à incapacidade deste método radiográfico derivado de pesquisa óssea, projetado para representar elementos mais densos, como o cálcio, de detectar tecidos moles não radiolúcidos (Rüegsegger et al. 1996). No entanto, houve um progresso significativo na pesquisa baseada em micro-CT em outras áreas biomédicas, incluindo diferentes tipos de scanners de bancada, captura de informações de contraste de fase, protocolos de aquisição de escaneamento mais rápidos e eficazes e algoritmos de reconstrução. Juntas, essas inovações podem ser exploradas para imagem de tecidos moles (não calcificados) superando sua limitação inerente. Para isso, uma melhoria específica na visualização de tecidos moles pode ser alcançada usando agentes de contraste radioopacos para atingir a atenuação de raios-X, a chamada técnica de micro-CT com contraste aprimorado (CE-CT). Em resumo, o CE-CT é adequado para avaliar tecidos heterogêneos, como dentes.

Os agentes de contraste são compostos por agentes químicos específicos com um alto peso molecular capazes de se ligar naturalmente aos tecidos moles para criar 'contraste' de maneira eficaz. O agente de contraste utilizado no presente estudo foi o iodo inorgânico de Lugol (I₂KI), que foi introduzido pela primeira vez por Metscher (2009a), que testou vários protocolos de fixação de amostras e o potencial de coloração de vários compostos comercialmente acessíveis para vários tipos de tecidos moles. Até o momento, foi demonstrado que o iodo de Lugol tem uma alta afinidade por glicogênio (Fennerty 1999) e direciona-se a células epiteliais e tecidos moles de camundongos (Degenhardt et al. 2010, Baverstock et al. 2013). Assim, o potencial do iodo de Lugol para alcançar a imagem do tecido pulpar com micro-CT foi testado no presente estudo. Através de uma série de testes com vários protocolos de impregnação, dentes com cavidades de acesso convencionais imersos na solução de Lugol por 7 dias permitiram a impregnação eficaz do tecido pulpar (Figuras 3 e 7). No entanto, dois aspectos relacionados ao uso do método CE-CT para analisar restos pulpares longitudinalmente após a irrigação do canal radicular com solução de NaOCl podem ser preocupantes. O primeiro aspecto diz respeito à reação química do NaOCl com o iodo da solução de Lugol. Apesar dessa interação, a solução de Lugol não reduziu significativamente a capacidade proteolítica do NaOCl nas condições atuais. A segunda preocupação foi o potencial do NaOCl de reduzir o grau de contraste associado ao tecido pulpar impregnado com Lugol. O teste de radiopacidade revelou que a solução de Lugol era adequada para impregnar o tecido pulpar, uma vez que o NaOCl não interferiu em sua radiopacidade. Juntas, essas resultados confirmaram que a solução de Lugol pode ser usada como um agente de contraste para testar o tecido pulpar como substrato para a análise de protocolos de irrigação à base de NaOCl. Uma análise adicional focou na validação da solução de Lugol na identificação adequada do tecido pulpar. Para isso, foi utilizada a seção histológica à base de parafina para confirmar se o tecido pulpar impregnado com a solução de Lugol era visível nas imagens de micro-CT. Uma abordagem experimental foi então desenvolvida para comparar as seções histológicas com suas respectivas imagens adquiridas das pilhas de micro-CT, superando problemas típicos de alinhamento nesse tipo de análise correlativa. Os resultados confirmaram a identificação correta do tecido pulpar nas imagens de micro-CT impregnadas com Lugol e, assim, provaram a qualidade do protocolo de impregnação (Figuras 4 e 5).

É importante notar que, particularmente para pesquisas em endodontia utilizando o tecido pulpar remanescente como parâmetro de resultado, a abordagem CE-CT tem a clara vantagem de não se concentrar em uma avaliação ultraestrutural detalhada do tecido mole. Em vez disso, a CE-CT permite facilmente a avaliação quantitativa do tecido pulpar remanescente como um todo em experimentos longitudinais (ao longo do tempo) (Figuras 6 e 7). Do ponto de vista qualitativo, centenas de cortes transversais produzidos por dente pela CE-CT podem proporcionar uma melhor compreensão da estreita relação entre a anatomia interna dos canais radiculares e os protocolos de modelagem mecânica e irrigação. Isso ocorre porque a CE-CT fornece modelos 3D de alta resolução, que contêm informações fiéis à realidade sobre as dimensões, quantificação estrutural e características anatômicas de tecidos heterogêneos, como dentina e tecido pulpar. Ao mesmo tempo, esse método permite a avaliação da distribuição pré-operatória do tecido pulpar ao longo do espaço do canal antes dos procedimentos experimentais, mesmo após 7 dias sem qualquer protocolo de fixação. Este é um ponto importante, pois a quantidade e a localização do tecido pulpar podem atuar como um fator de confusão, afetando o resultado do experimento. Dessa forma, o uso do método CE-CT em dentes com polpas vitais parece ser válido e reproduzível, uma vez que o tecido pulpar estava distribuído por todo o sistema de canais radiculares em todos os dentes sadios. Estudos futuros utilizando este método inovador devem incluir a comparação de diferentes soluções irrigantes (soluções inertes vs soluções ativas) ao longo do tempo e protocolos de preparação sobre a eficiência de dissolução/remoção do tecido pulpar dos sistemas de canais radiculares. Melhorias adicionais nesse método também permitiriam sua aplicação em pesquisas in vivo utilizando CBCT, por exemplo. No momento, a metodologia atual requer que o agente de contraste esteja em contato com o tecido pulpar por pelo menos 7 dias e, em uma abordagem in vivo, também exigiria imagens tomográficas pré e pós-operatórias, que claramente precisam cumprir princípios éticos de pesquisa aceitáveis. Definitivamente, o protocolo atual deve ser validado in vivo utilizando CBCT. Por outro lado, pode ser aplicado com segurança in vivo utilizando dentes não cariados e não restaurados com polpas vitais programados para extração sem exames pré ou pós-operatórios. Por exemplo, após confirmar a condição vital da polpa por meio de testes convencionais, o protocolo quimio-mecânico pode ser aplicado in situ e a solução de contraste injetada no espaço do canal pulpar e a cavidade de acesso coronário restaurada para garantir que a solução de Lugol permaneça dentro do espaço do canal radicular. Em seguida, o dente pode ser extraído, armazenado e avaliado por meio de imagens de micro-CT após uma semana.

Em resumo, o estudo atual concentra-se em fornecer evidências preliminares, mas originais, para apoiar estudos longitudinais de CE-CT não destrutivos usando o tecido pulpar remanescente como parâmetro de resultado. Foi demonstrado que a CE-CT combina, em um único método, as principais vantagens da tecnologia de imagem de micro-CT (avaliação de tecido mineralizado) e métodos histológicos tradicionais (avaliação de tecido não mineralizado) para estudar procedimentos de desbridamento de canais radiculares, abraçando a possibilidade de avaliar, identificar e medir aquelas áreas do canal não afetadas nem pela preparação mecânica nem pelos protocolos de irrigação. Vale ressaltar que a CE-CT permite que a preparação mecânica do canal e os protocolos de irrigação sejam estudados de forma independente ou o efeito sinérgico combinado de procedimentos químicos-mecânicos.

Conclusões

A solução de Lugol permitiu a visualização do tecido pulpar em imagens de micro-CT. A solução de Lugol não foi afetada pelo NaOCl em sua radiopacidade e não interferiu na dissolução dos tecidos moles fixos e corados. Em termos práticos, a técnica de imagem de micro-CT com contraste aprimorado com a solução de Lugol apresentada aqui permite que o efeito da dissolução química e a remoção mecânica do tecido pulpar por procedimentos de limpeza e conformação sejam avaliados de forma independente ou em conjunto, tornando-a uma técnica muito útil na pesquisa endodôntica baseada em laboratório.

Autores: G. De-Deus, F. G. Belladonna, D. M. Cavalcante, M. Simões-Carvalho, E. J. N. L. Silva, J. C. A. Carvalhal, R. Q. Zamolyi, R. T. Lopes, M. A. Versiani, P. M. H. Dummer e M. Zehnder

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