Criação de grupos experimentais bem equilibrados para estudos laboratoriais comparativos em endodontia: uma nova proposta baseada em micro-CT e métodos in silico

Resumo

Objetivo: Apresentar um novo método para selecionar dentes anatomicamente correspondentes usando tecnologia de microtomografia computadorizada (micro-CT).

Metodologia: Incisivos mandibulares de raiz única com um único canal radicular (n = 60) foram selecionados e distribuídos em três grupos experimentais de acordo com o método utilizado para emparelhar 10 pares de dentes em cada grupo. No grupo 1, os pares de incisivos mandibulares foram selecionados aleatoriamente de um conjunto de dentes. No grupo 2, os dentes foram emparelhados com base na medição da largura do canal a 5 mm do ápice radicular usando radiografias tiradas nas direções bucolingual e mesiodistal. No grupo 3, os dentes foram escaneados (tamanho do pixel de 14,25 µm) e emparelhados com base nos aspectos anatômicos do canal radicular, denominados razão de aspecto (AR), volume e geometria tridimensional do canal. Após alocar os espécimes nos grupos 1 e 2, os dentes foram escaneados e a morfologia do canal avaliada como no grupo 3. Uma análise de regressão bivariada de Pearson foi realizada correlacionando os valores individuais de AR de cada par, e o coeficiente de correlação foi utilizado para estimar a força do processo de emparelhamento. Testes post hoc de Tukey para ANOVA unidirecional foram aplicados para comparações pareadas a um nível de significância de 5%.

Resultados: A micro-CT revelou que 100% das amostras apresentaram correlações fortes (80%) ou muito fortes (20%) em relação aos valores de AR. A análise do método radiográfico revelou correlação forte em dois pares (20%), mas a maioria das amostras teve coeficientes de correlação fracos (30%) ou negligíveis (30%). O método de randomização resultou em três pares (30%) com correlações muito fortes, enquanto 50% apresentaram taxas fracas ou negligíveis. Uma diferença significativa nos coeficientes de correlação foi observada no método micro-CT em comparação com os outros grupos (P < 0,05), enquanto nenhuma diferença foi detectada entre os métodos radiográfico e randomizado (P > 0,05). Cálculos de Eta-quadrado (g2) demonstraram um tamanho de efeito muito alto no grupo micro-CT para seleção de pares (0,99) e tamanhos de efeito menores nos grupos radiográfico (0,67) e randomizado (0,66).

Conclusões: O método micro-CT foi capaz de fornecer melhor controle do efeito de confusão que as variações anatômicas na morfologia dental podem ter nos resultados em experimentos com desenho de pares correspondentes.

Introdução

Testes experimentais em bancada têm sido frequentemente utilizados para triagem e classificação da qualidade de uma infinidade de materiais e técnicas relacionadas ao modelamento de canais radiculares, irrigação, desinfecção e procedimentos de preenchimento (Buck et al. 1999, Eldeniz & Ørstavik 2009, Çapar et al. 2014, Passalidou et al. 2018). No entanto, os resultados e conclusões de alguns desses estudos comparativos podem não ser confiáveis devido à falta geral de correspondência anatômica dos dentes antes da experimentação (De-Deus 2012). Essa falta de padronização revela uma validade interna inconsistente e pobre desses estudos, o que está em linha com a afirmação de Babb et al. (2009): ‘Embora os desenhos de testes que utilizam espaços de canal naturais tenham apelos pragmáticos para os clínicos, eles têm limitações severas do ponto de vista da ciência dos materiais’. De fato, a dificuldade de criar uma linha de base confiável usando dentes naturais extraídos é uma consequência da anatomia intrincada do sistema de canais radiculares, que é um fator de confusão decisivo.

No geral, grupos experimentais em estudos comparativos foram criados selecionando dentes de raiz única ou múltipla randomizados com tamanho de amostra limitado (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019). Na prática, isso significa uma padronização muito pobre e a incapacidade de garantir a comparabilidade experimental, pois pode resultar em grupos experimentais com grandes variações na linha de base do substrato (Smith & Steiman 1994, També et al. 2014). Consequentemente, esses estudos podem ter sido conduzidos sob condições experimentais diferentes e os resultados podem revelar o efeito da anatomia do canal radicular em vez da variável de interesse, que são materiais, técnicas e/ou instrumentos em comparação (De-Deus 2012). Para superar esse problema e otimizar o desenho experimental, o emparelhamento anatômico da morfologia do canal radicular deve ser considerado como um primeiro passo experimental subjacente a qualquer estudo comparativo ex vivo em endodontia. Isso proporcionará uma linha de base consistente e uma melhoria da validade interna geral do estudo. Portanto, vários estudos tentaram superar o fator anatômico utilizando o exame visual de radiografias tiradas em diferentes angulações (Yared & Bou Dagher 1994, Bürklein & Schäfer 2012) alocando os dentes em grupos experimentais de acordo com a largura do canal radicular medida a uma certa distância do ápice radicular (Ruckman et al. 2013). No entanto, a qualidade geral dessa abordagem metodológica não é baseada em evidências. Pode-se especular que isso está, de fato, longe do ideal, considerando as variações bem conhecidas da forma do canal ao longo da raiz (Versiani et al. 2012, 2016a). Outra abordagem sugere o uso de dentes contralaterais (Johnsen et al. 2017), que demonstraram ter anatomia semelhante (Zehnder et al. 2006, Mitchell et al. 2011, Iriboz et al. 2015, Viapiana et al. 2016, Guimaraes et al. 2017). Através do uso da tecnologia de imagem de tomografia computadorizada micro (micro-CT), foi demonstrado que pré-molares contralaterais realmente exibem um alto grau de simetria de correspondência e um método de simulação computacional válido e confiável (in silico) foi desenvolvido para emparelhar pré-molares contralaterais em estudos comparativos endodônticos experimentais (Johnsen et al. 2016, 2017, 2018). No entanto, essas descobertas não impediram o uso de outros tipos de dentes, mas sugeriram que seria concebível emparelhar dentes de indivíduos diferentes se eles estiverem dentro de uma certa faixa de semelhança morfológica (Johnsen et al. 2016). A faixa, ou o menor coeficiente de semelhança aceitável, certamente dependeria de uma validação adicional e ainda precisa ser determinada. Assim, esse tipo de repositório de banco de dados de espaços pulpares não contralaterais abriria oportunidades para estudos extremamente seletivos, bem como, eficientes em termos de tempo e custo.

O objetivo do presente estudo foi introduzir uma nova metodologia para agrupar incisivos mandibulares não contralaterais em grupos experimentais com base em sua morfologia interna por meio da utilização da tecnologia de imagem de micro-CT. Esta proposta visa melhorar a validade interna de estudos comparativos em endodontia pela criação de grupos experimentais anatomicamente bem equilibrados em comparação com métodos convencionais baseados em randomização ou exame radiográfico. Para confirmar a similaridade anatômica dos dentes, os dados obtidos foram analisados com ênfase particular na razão de aspecto (AR) do canal ao longo de todo o comprimento da raiz. Este parâmetro pode ser considerado um indicativo de similaridade morfológica entre diferentes dentes. Além disso, as vantagens e limitações desta nova proposta também foram cuidadosamente abordadas. A hipótese nula testada foi a de que não haveria diferença nos coeficientes de correlação entre os três métodos testados.

Materiais e métodos

Cálculo do tamanho da amostra

Com base nos resultados de Versiani et al. (2013a), foi estimado um tamanho de efeito de 0,7 para o método de seleção a fim de obter amostras adequadamente pareadas anatomicamente utilizando a tecnologia de micro-CT. Este valor foi inserido em uma família de teste t-, método de correlação bi-serial no G*Power para Mac 3.1 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Alemanha), juntamente com um erro tipo alfa de 0,5 e potência beta de 95%. O software indicou um número de 16 amostras (oito pares) por grupo para observar um efeito significativo dos critérios de seleção utilizando micro-CT em relação aos métodos convencionais baseados em randomização ou exame radiográfico.

Seleção de amostras e grupos

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional local (protocolo 87450517.5.0000.5243). Um total de 1708 incisivos mandibulares de raiz única que foram armazenados nos últimos 4 anos em um banco de dentes do Departamento de Endodontia da Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, Brasil, estavam disponíveis para este experimento. Os critérios de inclusão compreendiam apenas dentes que não apresentavam fratura radicular, calcificação, cárie, reabsorção ou formação radicular incompleta. A partir deste conjunto de dentes, três grupos experimentais foram criados de acordo com os seguintes métodos.

Grupo 1 – Método randomizado (n = 20)

De um conjunto dos primeiros 76 incisivos mandibulares coletados aleatoriamente da amostra original (n = 1708), foi possível coletar 20 dentes com 20 ± 1 mm de comprimento (da borda incisal até o ápice anatômico) e distribuí-los aleatoriamente em dois subgrupos (n = 10) com a ajuda de um algoritmo de computador (http://www.random.org).

Grupo 2 – Método radiográfico (n = 20)

De mais 100 incisivos mandibulares coletados aleatoriamente da amostra original (n = 1708), foi possível selecionar 10 pares de dentes com largura de canal semelhante medida a 5 mm do ápice anatômico (software FIJI/ImageJ v.1.51n; Fiji, Madison, WI, EUA) utilizando projeções radiográficas digitais (sistema radiográfico digital Schick CDR; Dentsply Sirona, Charlotte, NC, EUA) tiradas tanto das direções bucolingual quanto mesiodistal de cada espécime.

Grupo 3 – Método Micro-CT (n = 20)

Duzentos e cinquenta e um incisivos mandibulares (n = 251) coletados aleatoriamente da amostra original (n = 1708) foram necessários para a criação de dois grupos pareados anatomicamente (n = 10) com base em uma abordagem de micro-CT. Assim, 251 espécimes foram escaneados (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Bélgica; 70 kV, 114 mA, tamanho de pixel de 14,25 lm, rotação de 360° com um passo de rotação de 0,5°, média de quadro de cinco, utilizando um filtro de alumínio de 1,0 mm de espessura) e reconstruídos em seções transversais axiais (software NRecon v.1.7.16; Bruker microCT) com parâmetros individualizados para correção de artefatos de anel (3–4), limites de contraste (0–0,05) e correção de endurecimento do feixe (30–45%), resultando em 700–900 imagens de seções transversais em escala de cinza por dente, da junção cemento-esmalte até o ápice. Em seguida, as imagens seccionais foram segmentadas para identificar a configuração do canal radicular (Figura 1a) usando uma rotina automática no software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji). Resumidamente, um filtro de médias não locais (Buades et al. 2011) foi utilizado para reduzir o ruído enquanto preservava as bordas dos objetos (Figura 1b), seguido pela aplicação do algoritmo baseado em Otsu (Otsu 1979) para binarização (Figura 1c). Para segmentar o canal radicular, as três etapas de 'preencher buracos' em 2D foram adicionadas à rotina automática após o re-corte adequado do volume para revelar os três planos ortogonais (xy, xz e yz). Depois disso, pequenos pixels residuais foram removidos automaticamente com a ferramenta 'Manter Maior Região' implementada no plugin MorphoLibJ (Legland & Arganda-Carreras 2014), que permite a identificação do maior componente conectado, removendo os desconectados (Figura 1d). A partir desse ponto, apenas espécimes com um único canal radicular (configuração de canal tipo I de Vertucci) foram utilizados. O volume de interesse (VOI) foi então estabelecido da junção cemento-esmalte até o ápice para medir os parâmetros de AR e volume do canal radicular. O AR é definido como a razão do diâmetro maior pelo diâmetro menor e foi calculado em cada seção transversal a partir da aposição de uma elipse que melhor se ajusta ao canal radicular usando o plugin Shape Descriptors do software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji; Figura 1e). Os resultados de AR adquiridos em todas as fatias foram plotados em um gráfico (Figura 1f) para descrever as variações da geometria 2D do canal ao longo da raiz. Canais com AR próximo a 1 apresentam uma forma arredondada, enquanto valores de AR superiores a três indicam forma oval ou alongada do canal. O volume (em mm3) foi calculado como o volume do canal binarizado dentro do VOI usando a ferramenta Objects Counter (software FIJI/ImageJ). Modelos tridimensionais (3D) da raiz e do canal radicular de cada espécime também foram criados usando o software CTAn v.1.18.8 (Bruker microCT) e avaliados qualitativamente a partir das vistas bucal e proximal com o software CTVol v.3.3 (Bruker microCT; Figura 1g). Depois disso, a alocação de amostras em pares anatômicos foi realizada. Primeiro, subgrupos de dentes foram criados de acordo com o volume do canal radicular com uma variação máxima de 2 mm3. Foi determinado com a ajuda de um teste estatístico apropriado (teste alfa de Cronbach) que indicou uma homogeneidade muito alta dos dados (0,968) quando as amostras foram categorizadas dentro dessa variação máxima de volume. Além disso, a geometria 2D de todo o canal radicular, representada pela curva gráfica de AR (Figura 1f), foi comparada. Dentes categorizados dentro da mesma faixa de volume de canal e mostrando curvas gráficas semelhantes foram reagrupados. Finalmente, o aspecto morfológico 3D dos canais radiculares (Figura 1g) nesses grupos foi examinado e os espécimes alocados em dois grupos de dentes pareados anatomicamente (n = 20) com base em volume semelhante, gráficos de AR e renderizações 3D dos canais radiculares. Dois operadores experientes verificaram independentemente esses parâmetros antes da distribuição das amostras.

Após alocar todos os espécimes nos três grupos experimentais, os dentes selecionados nos grupos 1 e 2 também foram escaneados e reconstruídos com o dispositivo de micro-CT SkyScan 1173 (Bruker microCT) seguindo os mesmos parâmetros utilizados no grupo 3. Em seguida, os valores de AR em cada seção transversal, bem como o volume e a configuração 3D dos canais radiculares foram obtidos dos espécimes dos grupos 1 e 2 e utilizados para comparação. Um fluxograma detalhado da metodologia é mostrado na Figura 2.

Análise estatística

Uma análise de regressão bivariada de Pearson foi realizada correlacionando os valores individuais de AR de cada par. O coeficiente de correlação obtido para cada par foi utilizado para estimar a força do emparelhamento do par juntamente com os comprimentos das raízes, seguindo a regra geral de força das correlações e categorizado como muito forte (0,9–1,0), forte (0,7–0,9), moderado (0,5–0,7), fraco (0,3–0,5) ou negligível (0–0,3; Cohen 1988). Em seguida, os coeficientes de correlação foram comparados entre os grupos para verificar a similaridade de sua força em relação aos métodos utilizados para formar amostras emparelhadas. Como uma distribuição em forma de sino foi observada para os coeficientes de correlação, um procedimento de ANOVA de uma via foi realizado, seguido por um teste HSD de Tukey para comparações pareadas. Além disso, o tamanho do efeito de cada método foi calculado usando o eta ao quadrado (g2). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Statistical Package for Social Sciences (SPSS v.24; SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) com um nível de corte para significância adotado em 5%.

Resultados

A Tabela 1 mostra os coeficientes de correlação de cada par de dentes pareados usando os três métodos de amostragem. O método de micro-CT (grupo 3) apresentou 100% das amostras classificadas como correlações fortes (80%) ou muito fortes (20%) em relação aos valores de AR. A análise do método radiográfico (grupo 2) revelou correlação forte em dois pares (20%), mas a maioria das amostras teve coeficientes de correlação fracos (30%) ou negligenciáveis (30%). Usando o método de randomização (grupo 1), apenas um par (10%) foi classificado com correlação muito forte e dois pares (20%) com correlação forte, enquanto 50% alcançaram taxas fracas ou negligenciáveis. Os testes post hoc Tukey’s HSD da ANOVA de uma via encontraram uma diferença significativa nos coeficientes de correlação alcançados pelo método de micro-CT em comparação com os outros grupos (P = 0.000), enquanto nenhuma diferença foi detectada entre os coeficientes de correlação dos pares radiográficos e randomizados (P > 0.05). Cálculos de Eta-quadrado (g2) demonstraram um tamanho de efeito muito alto no grupo de micro-CT para seleção de pares (0.99) e tamanhos de efeito menores nos métodos radiográfico (0.67) e randomizado (0.66). As Figuras 3, 4 e 5 ilustram os resultados obtidos a partir de amostras representativas de pares pareados em cada grupo.

Discussão

O principal desafio na criação de grupos experimentais bem equilibrados para estudos comparativos em endodontia são as variações na anatomia intrincada que podem existir em um grupo randomizado de dentes. Portanto, um objetivo importante dos experimentos laboratoriais ex vivo deve ser criar um método viável capaz de superar a variação interna inerente nos dentes humanos naturais (Versiani et al. 2013a). Antes do desenvolvimento da proposta atual, foi realizada uma busca na literatura para identificar os métodos mais comumente utilizados para criar amostras de dentes pareados em estudos experimentais em endodontia. Basicamente, esses métodos visavam alocar amostras em grupos experimentais de acordo com suas características anatômicas. Observou-se que alguns estudos adotaram um ponto da raiz, geralmente 5 mm do ápice anatômico, e mediram a largura do canal radicular nas direções bucal e proximal, seguindo a metodologia de Wu et al. (2000), para determinar sua forma (Tinoco et al. 2014, Teixeira et al. 2015, Lee et al. 2019). Em outros estudos, os espécimes são alocados do mesmo grupo de dentes por randomização (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019), enquanto alguns deles adotaram uma combinação de métodos radiográficos e randomizados para formar pares (Ruckman et al. 2013, Bernardes et al. 2016). Recentemente, alguns estudos começaram a usar parâmetros anatômicos específicos identificados por meio de uma varredura de micro-CT para amostras pareadas (Versiani et al. 2013b, Johnsen et al. 2016, Versiani et al. 2016b, Johnsen et al. 2017, 2018). De fato, o apelo para a exploração de um protocolo científico de triagem e pareamento adequado para uso em estudos comparativos em endodontia foi recentemente levantado por Xu et al. (2016) em sua proposta oportuna e apropriada de usar pré-molares contralaterais para fornecer consistência de base. Ao contrário de Johnsen et al. (2017), eles encontraram relativamente poucos pares de pré-molares contralaterais com simetria anatômica. No entanto, em concordância com Johnsen et al. (2017), eles descobriram que os dentes contralaterais tinham melhor simetria do que os dentes não pareados. Pesquisas futuras devem explorar se a semelhança dos dentes não pareados triados e pareados por meio da proposta atual de usar micro-CT para pareamento é comparável com pré-molares contralaterais. No entanto, a disponibilidade de dentes pré-molares contralaterais com ápices maduros extraídos de pacientes mais jovens em tratamento ortodôntico pode ser limitada. O presente estudo foi baseado em um grande material humano ex vivo de 1708 incisivos mandibulares. Os dentes passaram por um rigoroso processo de seleção para criar dois grupos anatomicamente pareados com base em métodos de micro-CT e radiográficos e um grupo alocado por randomização, com cada grupo consistindo de 10 pares de incisivos mandibulares. O rigoroso método de seleção a partir de um grande repositório de dentes, juntamente com o cálculo adequado do tamanho da amostra a priori, permitiu a possibilidade de demonstrar qual grupo tinha os melhores pares experimentais bem equilibrados, avaliando estatisticamente quão forte é a semelhança entre a forma interna do canal radicular entre os pares, com base nas correlações dos valores AR transversais.

Os baixos coeficientes de correlação obtidos tanto pelos métodos radiográficos quanto pelos métodos de randomização no presente estudo demonstram que os métodos de randomização e correspondência radiográfica não foram capazes de superar a variação biológica inerente à anatomia do canal radicular. Assim, a hipótese nula foi rejeitada. Esses resultados demonstraram claramente como estudos comparativos em endodontia que utilizam triagem e correspondência não sofisticadas requerem um aumento no tamanho da amostra para mostrar diferenças reais e estatisticamente significativas. Na verdade, um aumento no tamanho da amostra provavelmente levará a mais precisão, uma vez que as diferenças individuais terão menos importância, mas pode chegar a um ponto em que o efeito sobre a precisão se torna irrelevante (Souza 2014). Deve-se ressaltar que considerações éticas e econômicas também são incentivos importantes para não ter tamanhos de amostra maiores do que o necessário. Portanto, grupos correspondidos e bem equilibrados podem fornecer tamanhos de amostra menores com poder suficiente para fornecer resultados confiáveis. De fato, o efeito que a correspondência da amostra inicial tem na redução do tamanho da amostra já foi demonstrado anteriormente com resultados notáveis em pesquisas ósseas (Banse et al. 1996, Barker et al. 2005).

A metodologia apresentada abre caminho para o uso futuro de métodos de correspondência 3D e recuperação de objetos (Hilaga et al. 2001, Osada et al. 2001, Tangelder & Veltkamp 2008) com capacidades de aprendizado profundo ou redes neurais artificiais (Hilaga et al. 2001, Ekert et al. 2019, Krois et al. 2019). Tais capacidades incorporadas em uma interface amigável e semi-automatizada permitiriam a seleção rápida in silico de dentes com a morfologia de canal radicular desejada, como canais em forma oval, e então coletar as amostras fisicamente de um biobanco de dentes disponível para uma multiplicidade de diferentes experimentos comparativos em endodontia com alta validade interna. O novo método de micro-CT apresentado aqui remove de forma eficaz o efeito confusor que as variações anatômicas na morfologia do canal radicular podem ter nos resultados em desenhos experimentais pareados. Isso terá implicações inequívocas para a distribuição de amostras em grupos experimentais a fim de melhorar o design de estudos comparativos em endodontia.

Conclusão

O uso de Micro-CT foi capaz de proporcionar um melhor controle do efeito confusor que as variações anatômicas na morfologia dental podem ter nos resultados em experimentos com design pareado.

Autores: G. De-Deus, M. Simões-Carvalho, F. G. Belladonna, M. A. Versiani, E. J. N. L. Silva, D. M. Cavalcante, E. M. Souza, G. F. Johnsen, H. J. Haugen & S. Paciornik

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