Frequência de DNA dos principais tipos de vírus oncogênicos na estrutura do câncer de células escamosas e na mucosa oral normal
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Resumo
Relevância. A incidência de neoplasias malignas na mucosa da cavidade oral, e principalmente a mortalidade decorrente dessa patologia, ainda permanece em um nível significativo na Rússia. Em razão disso, a busca por fatores prognósticos e preditivos informativos é uma tarefa atual para os especialistas que tratam tumores da mucosa da cavidade oral.
Objetivo. Determinar a frequência de detecção do DNA de vírus oncogênicos na mucosa normal e em focos de câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral.
Materiais e métodos. Foi realizado um estudo prospectivo, que incluiu 50 voluntários saudáveis e 116 pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral verificado pela primeira vez. Todos os examinados foram submetidos à detecção do DNA dos tipos I e II do VPH, CMV, EBV, tipos 6 e 11 do VPH, e tipos 16 e 18 do VPH por meio de PCR em tempo real.
Resultados. Foi identificada uma ocorrência significativamente mais rara do DNA do HPV-18 em pacientes com câncer de células escamosas em comparação com a mucosa normal (o HPV-18 foi identificado 2,8 vezes menos frequentemente (p < 0,0001)). Na estrutura do câncer de células escamosas e na mucosa normal da cavidade oral, foi encontrada uma associação significativamente mais frequente da mucosa normal da cavidade oral com o HPV-18, tanto em monoassociação – 19 (18,0%) dos indivíduos no grupo controle em comparação com o grupo principal – 6 (5,2%) (p=0,008), quanto em combinação com o vírus Epstein-Barr: 7 (14,0%) (grupo controle) em comparação com 5 (4,3%) (grupo principal) (p = 0,03). Também foram obtidas diferenças significativas na análise da combinação do HPV-18 com o citomegalovírus, que foi identificada apenas no grupo controle – 2 (4,0%) (p = 0,03).
Conclusão. A análise realizada sugere que a presença do DNA do HPV, tipo 18, nas células do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral pode ser um fator de curso favorável da doença.
A incidência de neoplasias malignas da mucosa da cavidade oral, e o mais importante - a mortalidade decorrente dessa patologia, continua a permanecer em um nível significativo tanto no mundo como um todo, quanto na Rússia em particular. De acordo com dados do MNIOLI nomeado após P.A. Gertsen (filial do FGBU "NMIC de Radiologia" do Ministério da Saúde da Rússia), a mortalidade anual decorrente dessa patologia (segundo dados de 2017) se aproxima de 50% de todos os casos de doença diagnosticados pela primeira vez. A formação morfológica do foco de câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral é um processo complexo e multifásico, e os fatores etiológicos fundamentais para seu desenvolvimento são o tabagismo, o abuso de álcool e a higiene bucal inadequada, que afetam negativamente a estrutura da mucosa normal, especialmente em indivíduos com predisposição genética ao desenvolvimento de oncopatologia. Além dos fatores de risco amplamente conhecidos para o surgimento do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral e das doenças pré-neoplásicas registradas, existe uma série de fatores, como infecções virais e inflamação, que podem ser um elo importante na patogênese de doenças malignas e podem potencializar o desenvolvimento de 15-20% das neoplasias malignas.
Objetivo da pesquisa
Determinar a frequência de detecção do DNA dos vírus do herpes simples tipo I e II (VHS-I,II), citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (VEB) e dos vírus do papiloma humano dos tipos 6, 11, 16 e 18 (VPH-6,11, VPH-16, VPH-18) na mucosa oral normal e em focos de câncer de células escamosas da mucosa oral.
Materiais e métodos da pesquisa
Para alcançar o objetivo proposto, foi realizado um estudo prospectivo, que incluiu 50 voluntários saudáveis (grupo controle), que estavam sob observação ambulatorial na clínica de cirurgia maxilofacial e plástica da GBOU VPO SPbGMU nomeado após o acadêmico I.P. Pavlov, no período de 2012 a 2013, e 116 pacientes (grupo principal), aos quais foi verificado pela primeira vez o diagnóstico de "câncer de células escamosas da mucosa oral" no SPb GBUZ "Dispensário Oncológico Clínico Municipal" no período de 2012 a 2013. O período total de observação durou até 17.07.2019, após o qual foi realizada a análise final dos dados.
Critérios principais para inclusão de pacientes com câncer de células escamosas da mucosa oral no estudo:
Assinatura do formulário de consentimento informado voluntário para participação no estudo.
Idade, acima de 18 anos.
Verificação morfológica do diagnóstico de "câncer de células escamosas da mucosa oral".
Critérios principais para exclusão de pacientes com câncer de células escamosas da mucosa oral no estudo:
Metástases distantes de câncer de células escamosas da mucosa oral identificadas.
Critérios principais para inclusão no grupo de voluntários saudáveis:
Assinatura do formulário de consentimento informado voluntário para participação no estudo.
Idade, acima de 18 anos.
Ausência de doenças registradas no momento da inclusão no estudo da mucosa oral de natureza inflamatória, tumoral ou de outra natureza.
Critérios principais para não inclusão no grupo de voluntários saudáveis:
Verificação histológica do diagnóstico de "câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral".
Características gerais dos pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral.
No grupo principal, havia 77 homens (66,38%) e 39 mulheres (33,62%). A idade média dos pacientes foi de 60,80 ± 0,96 anos (IC 95% 58,90-62,70).
Em 49 (42,24%) pacientes, o foco tumoral primário estava localizado na região da parte anterior e média da língua, em 32 (27,60%) a mucosa do assoalho da cavidade oral. A mucosa da parte alveolar da mandíbula foi afetada em 8 (6,90%) pacientes, a bochecha em 7 (6,03%) pacientes. Menos frequentemente, foram afetados o arco palatino anterior e a mucosa do sulco pterigomandibular - em 3 (2,59%) pacientes, o processo alveolar da maxila, a região retromolar e o palato duro - em 2 (1,72%) pacientes, e o palato mole e o lábio inferior - em 1 (0,86%) paciente, respectivamente.
Estágios iniciais da doença (0, I e II) foram diagnosticados em 24 (20,69%) pacientes (1,72%, 5,17% e 13,80%, respectivamente). Em 18 (15,52%) pacientes foi identificada a III fase da doença, e mais da metade dos pacientes – 68 (58,62%) – procuraram atendimento já na fase IVA. Em 6 (5,17%) pacientes, o tumor primário foi considerado irresecável (T4b) ou a infiltração dos linfonodos regionais excedeu 6 cm (N3) – fase IVB.
O estudo histológico realizado revelou que em 35 (30,17%) a diferenciação do tumor foi alta (G1), em 34 (29,31%) – moderada (GII), e em 13 (11,21%) pacientes o grau de diferenciação do tumor foi baixo (GIII). Em um terço dos casos – 34 (29,31%) – o grau de diferenciação não foi determinado.
Em 51 (43,97%) casos foram identificados sinais histológicos de queratinização, em 29 (25,00%) casos o tumor não apresentava sinais de queratinização, em 5 (4,31%) o grau de queratinização foi determinado como parcial, e em 31 (26,72%) amostras a presença de queratinização não foi avaliada.
Caracterização geral de voluntários saudáveis.
O grupo de voluntários saudáveis foi composto por 30 (60,0%) homens e 20 (40,0%) mulheres. A idade média foi de 55,7 anos (95% IC 47,60-61,35).
34 (68,0%) dos respondentes procuraram consulta sobre implante dentário, 12 (24,0%) dos respondentes necessitaram de preparação cirúrgica para tratamento ortodôntico e 4 (8,0%) dos respondentes foram consultados sobre retenção/distopia dental. Os grupos formados eram comparáveis em relação aos dados demográficos - sexo e idade.
Método de detecção de DNA de vírus por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
A coleta de material foi realizada sob anestesia local infiltrativa a partir do tumor primário de pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral e gengiva da mandíbula superior ou inferior de voluntários saudáveis; o tamanho da amostra foi de 0,5 x 0,5 cm. Após a coleta, a amostra foi fixada em solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e congelada a uma temperatura de -25 °C.
A detecção do DNA viral foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real (Laboratório de Diagnóstico Molecular da GBOU VO PsPbGMU nomeado em homenagem a I.P. Pavlov). Para a detecção qualitativa do DNA, foram utilizados kits de diagnóstico especializados, de acordo com as instruções dos fabricantes. A sensibilidade dos métodos de PCR era padrão de 102 cópias gênicas em uma amostra.
Metodologia de análise estatística.
As variáveis que refletem características foram analisadas por meio de estatística descritiva. Com o objetivo de determinar as categorias descritivas das variáveis quantitativas, elas foram avaliadas quanto à normalidade da distribuição utilizando o teste de Shapiro-Wilk. Em todos os casos, os dados obtidos seguiram uma distribuição normal, razão pela qual sua descrição foi realizada por meio da média amostral e do erro da média (M ± m). A comparação entre os grupos de sujeitos quanto à frequência de ocorrência da característica foi realizada utilizando o teste z (com correção de Yates para continuidade). Todos os indicadores foram calculados com um intervalo de confiança (IC) de 95% bilateral e um valor de p bilateral. O tratamento estatístico foi realizado com o pacote de programas aplicados Statistica® (StatSoft, ver. 12.0) e MedCalc® (ver. 19.0.7).
Resultados da análise da frequência de detecção do DNA de vírus por PCR em tempo real
A análise realizada permitiu estabelecer que a frequência de ausência de DNA viral em ambos os grupos foi a mesma, com 54 (46,6%) pacientes do grupo principal não apresentando DNA viral na estrutura do tumor, enquanto no grupo controle o DNA viral estava ausente em 17 (34,0%) dos examinados (p = 0,13). Na restante coorte examinada, o DNA do vírus Epstein-Barr (EBV) foi detectado significativamente mais frequentemente em 40 (34,48%) pacientes do grupo principal (p < 0,0001) e em 15 (30,00%) voluntários saudáveis (p = 0,03). O câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral foi significativamente mais associado ao DNA dos vírus do papiloma humano, tanto no total em 48 (41,4%) dos casos (p < 0,0001), quanto pelos subtipos considerados: HPV-6,11 – 16 (13,8%) (p = 0,005), HPV-16 – 12 (10,3%) (p = 0,001), HPV-18 – 20 (17,2%) (p < 0,0001). No grupo controle, o DNA do HPV foi detectado significativamente mais frequentemente apenas no total – 27 (54,0%) (p < 0,0001), e no HPV-18 – 24 (48,0%) (p < 0,0001).
A análise comparativa da frequência de registro do DNA viral em ambos os grupos permitiu identificar os seguintes resultados, apresentados na tabela 1.
Durante nossa pesquisa, foi identificada uma ocorrência significativamente mais frequente do DNA do HPV-18 nas células da mucosa da cavidade oral de voluntários saudáveis em comparação com pacientes com câncer de células escamosas – no grupo controle, o HPV-18 foi encontrado 2,8 vezes mais frequentemente (p < 0,0001).
No entanto, deve-se entender que o DNA de apenas um tipo de vírus no grupo principal foi identificado em apenas um terço dos pacientes – 34 (29,3%), enquanto no controle – em 19 (38,0%) dos examinados (p = 0,14). Dois tipos de DNA viral também foram registrados com a mesma frequência tanto no grupo principal – 24 (20,7%) quanto no grupo controle – 14 (28,0%) (p = 0,16). A associação de três ou quatro tipos de DNA viral foi identificada apenas em pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral – 3 (2,6%) e 1 (0,9%) (p = 0,26) (tabela 2).
Os resultados da subanálise das combinações de vírus na estrutura do câncer de células escamosas e da mucosa oral normal revelaram uma associação significativamente mais frequente da mucosa oral normal com o HPV-18, tanto na monoassociação – 19 (18,0%) dos indivíduos no grupo controle em comparação com o grupo principal – 6 (5,2%) (p = 0,008), quanto na combinação com o vírus Epstein-Barr: 7 (14,0%) (grupo controle) em comparação com 5 (4,3%) (grupo principal), (p = 0,03). Também foram obtidas diferenças significativas na análise da combinação do HPV-18 com o citomegalovírus, que foi identificada apenas no grupo controle – 2 (4,0%) (p = 0,03). Por outro lado, a combinação do EBV com o HPV-16 foi registrada apenas em 6 (5,2%) pacientes com câncer de células escamosas da mucosa oral, com tendência a uma maior frequência dessa combinação (p = 0,1).
Discussão
A análise que realizamos permitiu demonstrar de forma significativa que a ausência de associação da mucosa oral ocorre com a mesma frequência tanto na mucosa não alterada quanto nos focos de câncer de células escamosas, o que permite afirmar sobre a comparabilidade dos pacientes em questão.
Durante a pesquisa, registramos uma maior frequência de detecção do DNA do vírus do papiloma humano tipo 18 na estrutura da mucosa oral normal, tanto em monoassociação quanto na combinação do VPH-18 com outros tipos de vírus (EBV, CMV). Pesquisas semelhantes e resultados parecidos, principalmente em relação ao VPH-18, foram obtidos, por exemplo, por Yeudall W. A. e Campo M. S. (Reino Unido) em 1991: através da PCR, analisaram 25 amostras de mucosa oral normal, nas quais foi possível detectar DNA do VPH-18 em 8%, enquanto na estrutura do câncer de células escamosas, o DNA do VPH-18 foi identificado em 20,5% dos casos entre 39 examinados. No entanto, os dados da literatura são ambíguos: por exemplo, Saghravanian N. e co-autores (Irã) em 2011 analisaram 18 amostras de mucosa normal e 21 amostras de câncer de células escamosas da mucosa oral e descobriram que na mucosa não alterada, o DNA do VPH-16 e VPH-18 não foi detectado em nenhuma amostra, enquanto nos focos de câncer de células escamosas, houve 3 (14,3%) análises positivas para esses tipos de vírus. Em 2017, Liu T. e co-autores (China) através de análise imuno-histoquímica analisaram a frequência de associação de 22 amostras de mucosa oral normal e 6 amostras de câncer de células escamosas com VPH tipos 16 e 18, onde o DNA dos vírus foi detectado em 62,5% dos casos do grupo de voluntários saudáveis e em todos os 6 (100%) pacientes com oncopatologia. Os resultados da nossa pesquisa mostram de forma confiável que o câncer de células escamosas da mucosa oral está mais frequentemente associado ao DNA dos vírus do papiloma humano, tanto no geral em 41,4% (48) dos casos, quanto por subtipos virais individuais: VPH-6,11 – 13,8%, VPH-16 – 10,3%, VPH-18 – 17,2%, enquanto na mucosa normal, o DNA do VPH foi detectado de forma significativamente mais frequente apenas em conjunto – 54,0% e no caso do tipo VPH-18 – 48,0%, em comparação com os outros subtipos, que ocorreram com muito menos frequência.
Pesquisas russas dedicadas à questão em questão são extremamente raras, pode-se dizer que são únicas, e o número de pacientes examinados nessas pesquisas é pequeno. Um dos últimos estudos é o trabalho de Kiryanov S. A. e co-autores, apresentado no final de 2019: os autores examinaram 10 pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral em busca de DNA do HPV e EBV por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real, e descobriram que o DNA do HPV não foi encontrado em nenhuma amostra de tecido tumoral, enquanto o DNA do EBV foi identificado em 7 (70,0%) casos. Em nosso estudo, o DNA do vírus Epstein-Barr (EBV) foi detectado apenas em 34,48% (40) dos pacientes com câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral e em 30,00% (15) dos voluntários saudáveis.
A análise dos dados obtidos permite supor que a detecção do DNA do HPV tipo 18 nas células do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral pode ser um fator de curso favorável da doença, e os índices de sobrevida e a eficácia do tratamento antitumoral nesta coorte de pacientes prevalecerão sobre os índices correspondentes de pacientes negativos para HPV-18. Assim, a realização de nosso estudo em um material clínico significativo pode, possivelmente, permitir uma nova perspectiva sobre os vírus como um fator etiológico confiável no desenvolvimento do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral. Acreditamos que uma atenção especial deve ser dada à associação do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral com o HPV-18, como um provável fator etiológico no desenvolvimento da degeneração maligna das estruturas da mucosa da cavidade oral. No entanto, sem dúvida, é necessário um estudo mais profundo desta questão, com o objetivo de determinar o verdadeiro papel do fator viral no desenvolvimento e curso do câncer de células escamosas da mucosa da cavidade oral.
Kutukova S.I., Chukhlovin A.B., Yaremenko A.I., Ivaskova Y.V., Razumova A.Y., Ermakova T.S.
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