Escolhendo ovelhas (Ovis aries) como modelo animal para pesquisa da articulação temporomandibular: Caracterização morfológica, histológica e biomecânica do disco articular

Resumo

Os ensaios pré-clínicos são essenciais para o desenvolvimento de tecnologias científicas. Pesquisas moleculares e celulares notáveis foram realizadas utilizando modelos de pequenos animais. No entanto, existem diferenças significativas em relação ao comportamento articular entre esses modelos e os humanos. Assim, modelos de grandes animais podem ser mais apropriados para realizar ensaios envolvendo a articulação temporomandibular (ATM). O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização morfológica (dissecação anatômica e sistema de escaneamento 3D com luz branca), histológica (a ATM em bloco foi removida para análise histológica) e biomecânica (testes de tensão e compressão) da ATM de ovelhas, comparando os resultados obtidos com dados humanos. Os resultados mostraram que o processo condilar e a fossa mandibular das ovelhas são anatomicamente semelhantes às mesmas estruturas humanas. O disco da ATM possui um perímetro elíptico, mais fino no centro do que na periferia. A área periférica atua como uma estrutura em anel que suporta a zona central. As células do disco apresentam morfologia semelhante a fibroblastos e condrócitos. A área marginal é formada por tecido conjuntivo frouxo, com algumas células semelhantes a condrócitos e fibras de colágeno em diversas orientações. Os discos obtiveram um módulo de tensão de 3,97 ± 0,73 MPa e 9,39 ± 1,67 MPa, para avaliação anteroposterior e mediolateral. Os discos da ATM apresentaram um módulo de compressão (E) de 446,41 ± 5,16 MPa e seu valor máximo de tensão (σmax) foi de 18,87 ± 1,33 MPa. Os resultados obtidos sugerem que esses animais devem ser considerados como um modelo primário para pesquisa e treinamento procedural da ATM. Investigações adicionais no campo da cirurgia oromaxilofacial envolvendo a ATM devem considerar as ovelhas como um bom modelo animal devido à sua semelhança com a mesma articulação em humanos.

Introdução

Para melhorar a saúde humana, descobertas científicas e tecnologias devem ser traduzidas em aplicações práticas. Esses avanços geralmente começam com pesquisa básica e depois progridem para o nível clínico. Inerente ao desenvolvimento de novas tecnologias está o papel dos ensaios pré-clínicos utilizando modelos animais. Embora nenhum modelo animal possa replicar completamente as condições humanas, os modelos animais são fundamentais para a avaliação dos mecanismos da doença, teste de novas tecnologias e aplicação de novos procedimentos. A articulação temporomandibular (ATM) é a articulação mais frequentemente utilizada no corpo humano. A ATM abre e fecha 1500—2000 vezes diariamente e é essencial para funções cotidianas da boca, como mastigação, fala, deglutição, bocejo e ronco, envolvendo uma sinergia obrigatória especial de ambos os lados articulares. As superfícies articulares são convexas e, portanto, movimentos articulares suaves só são possíveis devido a um disco intra-articular entre elas. O disco da ATM é um componente essencial na ATM normal e tem as seguintes funções: distribui a carga intra-articular, estabiliza as articulações durante a translação e diminui o desgaste da superfície articular. O disco da ATM deslocado, malformado ou danificado pode induzir processos patológicos de desarranjo interno e/ou osteoartrite. Atualmente, pacientes que sofrem de disfunção temporomandibular severa (DTM) têm poucas opções de tratamento. Sem implantes de disco da ATM seguros e eficazes, muitos pacientes se submetem à discectomia: um procedimento cirúrgico que remove o disco da ATM lesionado com o objetivo de reduzir os sintomas severos da DTM. Este procedimento pode não ser o ideal, pois a ATM fica sem uma estrutura funcional importante. Desde os problemas anteriores associados a materiais aloplásticos usados para substituir o disco da ATM, como silicone e Proplast-Teflon (PTIPI, Vitek, Inc, Houston, Texas, EUA), muitos grupos descartaram a investigação nesta área. No entanto, o impacto potencial de um implante interposicional temporomandibular sintético (IITS) é imenso. As falhas do IITS sintético geralmente foram atribuídas à falta de conhecimento sobre os aspectos biomecânicos e bioquímicos da ATM. O desenvolvimento de novas tecnologias para engenharia de scaffolds em relação ao disco da ATM está crescendo e o modelo animal ideal para pesquisa sobre a ATM deve ser bem caracterizado. A escolha de um animal para o desenho experimental não é simples. Devido a diferenças fisiológicas e anatômicas entre a ATM humana e a de animais experimentais, não existe um modelo animal que seja válido por si só. A ATM é uma característica cardinal que define a classe Mammalia e separa os mamíferos de outros vertebrados. A ATM apresenta notável variação morfológica e funcional entre diferentes espécies, refletindo não apenas a grande adaptação dos mamíferos aos mecanismos de alimentação, mas também diferentes comportamentos biomecânicos. As variações morfológicas são correlatos de carga (por exemplo, tamanho das superfícies articulares) ou movimento (por exemplo, orientação da articulação), ou ambos. A carga da ATM é uma força de reação que surge da contração dos músculos mastigatórios; sua magnitude depende fortemente da posição do ponto de mordida em relação à linha de ação do músculo. Muitos animais de laboratório comumente usados, especialmente roedores, se enquadram na categoria de carga mínima da ATM, especialmente durante a mastigação. Em contraste, carnívoros como cães suportam cargas da ATM que são maiores do que as dos primatas. A abertura da mandíbula geralmente envolve uma combinação de rotação e deslizamento para frente (translação), mas alguns carnívoros perderam a capacidade de deslizar e alguns tamanduás especializados em vez disso usam uma rotação em torno do eixo longo da mandíbula curva. As variantes evolutivas mais extremas incluem:

• perda da cavidade sinovial em algumas baleias de barbatana;

• perda (ou possivelmente ausência primitiva) do disco em monotremados, alguns marsupiais e alguns edentados (tamanduás e preguiças);

• variações na orientação da cavidade articular de sagital (muitos roedores) a transversal (muitos carnívoros);

• inversão da relação usual convexa/concava, de modo que o processo condilar se torne o elemento feminino (muitos ungulados artiodáctilos, como ovelhas e gado).

Além disso, o tamanho relativo da articulação é extremamente variável. Ovelhas, coelhos e macacos foram usados como modelos de defeito do disco da ATM em muitos estudos. O modelo de macaco é pouco utilizado nos últimos anos, considerando o alto custo, a difícil operação cirúrgica e a aprovação ética. O coelho é uma excelente opção para estudos de deslocamento anterior do disco da ATM, mas o pequeno tamanho da ATM aumenta a dificuldade para o acesso cirúrgico e a manipulação do disco. Os autores concordam com outros estudos que consideram a ovelha uma opção válida para estudos da ATM devido ao tamanho da ATM, forma do processo condilar e fossa mandibular, tamanho do disco, morfologia e fixações. No entanto, uma caracterização bioquímica e biomecânica profunda da ATM de ovelhas está faltando na literatura disponível. Portanto, o objetivo do presente estudo foi examinar as propriedades morfológicas, histológicas e biomecânicas dos discos da ATM extraídos de ovelhas (Ovis aries). Foi hipotetizado que esses discos apresentariam alta semelhança com os dados disponíveis sobre a ATM humana.

Materiais e métodos

O material utilizado para este estudo foi obtido de ovelhas abatidas para consumo de carne. Um total de 15 cabeças de ovelhas fêmeas Black Merino, com 40 a 50 kg, foram utilizadas: 6 para caracterização morfológica, 4 para caracterização histológica e 5 para testes biomecânicos. Um dos principais requisitos para este estudo foi utilizar discos de ATM frescos; por essa razão, uma equipe de cirurgiões certificados estava disponível 5 dias por semana para coletar discos de ATM frescos até um máximo de 5 horas após a morte.

Em relação às considerações éticas sobre os animais, o presente desenho do estudo foi aprovado pela Autoridade Nacional Portuguesa de Saúde Animal.

Caracterização morfológica

Para a caracterização morfológica, 12 discos de ATM frescos foram coletados de seis cabeças de ovelhas. Foi realizada uma discectomia cirúrgica expondo e identificando as estruturas anatômicas da ATM. Todos os anexos musculares foram removidos para obter discos de ATM limpos. Os discos foram submersos por 5 minutos em uma solução ColorBond, um infiltrante de cura extremamente rápida, projetado para fortalecer rapidamente partes impressas em 3D. Essa submersão foi essencial para manter a morfologia correta para a digitalização em 3D. Um sistema de digitalização 3D com luz branca (Steinbichler — COMET 5^®) e o software apropriado foram utilizados para replicar os discos em um modelo virtual 3D. Uma vez removidos os discos, dois dos crânios foram fervidos em água (120ºC) por 2 h para permitir a obtenção de crânios limpos completos.

Caracterização histológica

Quatro cabeças de ovelhas foram utilizadas para conduzir a investigação histológica. As ATM foram removidas utilizando uma serra oscilatória de necropsia de osso de acordo com as seguintes referências anatômicas: cranial — aspecto cranial do processo coronoideu na seção do arco zigomático; caudal — externo ao meato acústico. A referência dorsal foi estabelecida ao osso temporal escamoso. A referência ventral foi 2 cm ventral ao meato acústico na zona do ângulo estilohióideo.

As articulações foram fixadas em formalina tamponada a 10% por dez dias. A desmineralização foi obtida por imersão em ácido fórmico a 10% por três semanas, após o que as articulações foram cortadas sagital e transversalmente através de todo o processo condilar. Após lavagem intensiva, os fragmentos foram submetidos a processamento rotineiro de tecidos com inclusão em parafina. Seções de quatro micrômetros foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e com Orceína para mostrar fibras elásticas no disco. Imagens digitais foram obtidas com uma câmera Olympus DP21.

Teste biomecânico

Cinco cabeças de ovelhas foram utilizadas para estudos biomecânicos. Os discos da ATM foram removidos e imersos em uma solução salina para transporte até as instalações de bioengenharia (máximo de 1 hora). Todos os anexos musculares e ligamentos foram removidos para obter um disco fibrocartilaginoso limpo. Dez discos limpos foram obtidos, mas um foi excluído devido a danos cirúrgicos. Consequentemente, 9 discos foram randomizados em 3 grupos e testados em diferentes testes mecânicos: Módulo de tensão (E), resistência à tração e alongamento foram testados em: testes anteroposteriores (APT) e testes mediolaterais (MDT).

Testes de compressão (CT) foram realizados usando testes de tensão-deformação. No caso do teste de tração anteroposterior, durante a carga, os discos da ATM foram esticados na direção representada em Fig. 1A, enquanto no teste de tração mediolateral a direção do estiramento foi conforme mostrado em Fig. 1B.

Resultados

Caracterização morfológica

Nas cabeças de ovelhas estudadas, a ATM foi localizada, como esperado, no segmento posterior do lado da face, cranioventral ao meato acústico externo, sendo uma articulação diartrodial, bicondilar que permite a abertura e fechamento normais da mandíbula. Compreendia a face articular superior, a fossa mandibularis do osso temporal e o processo condilar, como a superfície articular inferior (Figs. 2 e 6). Foi observado um processo coronoideus saliente (Fig. 2).

A superfície articular superior (fossa mandibularis) estava localizada na zona inferior do osso temporal, lateral ao forame oval e anterior ao meato acústico externo. A fossa mandibularis era maior anteroposteriormente do que mediolateralmente, com uma convexidade voltada para baixo. A superfície articular inferior (Fig. 3) é representada pelo processo condilar, com forma elipsoidal, com o eixo mais longo na posição mediolateral, as medidas médias sendo 23,47 mm de comprimento (σ = 0,87) e 8,32 mm de largura (σ = 1,54). O processo condilar era côncavo mediolateralmente. A fossa mandibularis recebe o processo condilar.

Com uma abordagem cirúrgica fácil, os autores localizaram o disco articular fibrocartilaginoso interposto entre a fossa mandibularis e o processo condilaris (Fig. 4). Este disco separa uma cavidade articular superior de uma inferior. A primeira era consistentemente maior que a segunda. As estruturas ósseas estavam revestidas com cartilagem, mais evidente no processo condilaris.

Nas ovelhas estudadas, o disco articular tinha uma forma elíptica, sendo substancialmente mais fino no centro do que na periferia. As regiões do disco da ATM são comumente classificadas como banda anterior, banda posterior e zona intermediária (Fig. 5). A zona intermediária apresenta diferenças de seus aspectos lateral a medial, sendo frequentemente subdividida em região lateral, medial e central. As bandas do disco são mais grossas do que a zona intermediária.

O comprimento e a largura médios dos 12 discos frescos de ATM analisados foram de 21,23 mm (σ = 1,53) e 11,49 mm (σ = 0,62), respectivamente. As espessuras das bandas anterior e posterior foram de 1,05 mm (σ = 0,07) e 1,27 mm (σ = 0,04), respectivamente. A espessura central média foi de 0,76 mm (σ = 0,09).

As mesmas medidas obtidas a partir dos modelos virtuais em 3D foram totalmente semelhantes às registradas nos discos frescos. Um relatório importante e consistente com toda a ATM foi a presença de fluido viscoso nos compartimentos superior e inferior. Este fluido não foi analisado.

Caracterização histológica

O estudo histológico da ATM de ovelha revelou que o disco articular estava preso anterior e posteriormente à cápsula articular composta por tecido fibroso. Tanto as superfícies da fossa mandibularis quanto do processus condylaris estavam cobertas por uma camada fibrocartilaginosa. No entanto, a camada fibrocartilaginosa que cobre o processus condylaris era consideravelmente mais espessa do que a camada que cobre a fossa mandibularis (Fig. 6).

A parte central fina do disco consistia em fibroblastos dispersos e feixes de fibras colágenas espessas e densamente empacotadas, dispostas principalmente em uma direção anteroposterior. As fibras de colágeno não eram retas, mas apresentavam evidências de um contorno ondulado. As porções anterior e posterior do disco eram, por sua vez, ocupadas por feixes de fibras colágenas com diversas orientações (Fig. 7). Em algumas áreas, essas duas porções mostraram células semelhantes a condrócitos residindo em lacunas distribuídas entre fibras de colágeno menos compactas (Fig. 7). Cada lacuna era cercada por uma quantidade mínima de matriz amorfa. A banda posterior se misturava, no espaço retrodiscal, com tecido conjuntivo frouxo com abundante suprimento sanguíneo e nervoso. Alguns vasos sanguíneos de pequeno calibre, cercados por tecido conjuntivo frouxo, foram observados em todas as partes do disco (Fig. 7). Também estavam presentes adipócitos uniloculares ocasionais tanto nas fixações anterior quanto posterior do disco.

Fibras elásticas positivas para orceína foram encontradas em todo o disco, sendo aparentemente mais abundantes na porção central mais fina. Nesta área do disco, as fibras elásticas estavam dispostas principalmente em paralelo aos feixes de colágeno (Fig. 8). Em vez disso, nas porções anterior e posterior do disco, as fibras elásticas mostraram uma distribuição reticular entre as fibras de colágeno e células semelhantes a condrócitos (Fig. 8).

Caracterização biomecânica

Na Tabela 1, as medidas dos discos utilizados nos testes mecânicos são apresentadas.

Os testes de tração realizados revelaram que os discos da ATM apresentaram comportamentos diferentes nas direções anteroposterior e mediolateral (Fig. 9).

Os resultados obtidos demonstraram que o módulo de tensão dos testes de tração mediolateral é maior do que o dos testes de tração anteroposterior, assim como a resistência à tração e a elongação na ruptura (Figs. 10 e 11).

Na Tabela 2 os resultados obtidos para os discos testados para módulo de tração, resistência à tração e alongamento até a ruptura estão resumidos.

Os testes mecânicos sob compressão foram realizados para avaliar o desempenho macro-mecânico dos discos da ATM.Fig. 12 demonstra as curvas de tensão-deformação sob compressão dos discos testados.

Os discos da ATM apresentaram um módulo de compressão (E) de 446,41 ± 5,16 MPa e seu valor máximo de estresse (σmax) foi de 18,87 ± 1,33 MPa.

Discussão

O disco da ATM é um tecido fibrocartilaginoso especializado, localizado entre o processo condilar e a fossa mandibular, conforme mostrado em nossa caracterização morfológica de ovelhas. Em humanos, o disco da ATM tem um perímetro elíptico, mais fino no centro do que na periferia. A periferia do disco atua como uma estrutura de anel, sustentando a zona central. O mesmo foi observado na morfologia do disco de ovelhas. As funções do disco da ATM são:

• melhorar o encaixe entre as superfícies ósseas;

• proporcionar estabilidade durante os movimentos mandibulares;

• distribuir as forças mastigatórias.

Essa capacidade se deve à alta concentração de fibras de colágeno. Essa estrutura em anel ao redor do disco é um aspecto estrutural importante para suportar as conexões do disco. A área de conexão é rica em fibras elásticas, o que é essencial para a mobilidade do disco na articulação. Como foi mostrado na caracterização morfológica da ATM de ovelhas, essa estrutura anatômica revelou várias características semelhantes à ATM em humanos, incluindo o diâmetro mediolateral sendo maior que o anteroposterior, o eixo longo do processo condilar direcionando-se para trás e uma maior inclinação condilar anterior. Uma das principais diferenças é a forma côncava do processo condilar mediolateral, que é convexo em humanos. O processo condilar forma uma pequena depressão anteroposterior e mediolateral para se encaixar exatamente na fossa mandibular, ao contrário do processo condilar humano, que é arredondado anteroposterior e mediolateral. A fossa mandibular é anteroposteriormente maior que mediolateral, com uma convexidade voltada para baixo, ao contrário da fossa mandibular em humanos, que é côncava para cima. A fossa mandibular permite o movimento mediolateral livre do processo condilar para a ruminação. O tubérculo articular, uma característica especial em humanos, é rudimentar nas ovelhas, uma vez que o caminho do movimento do processo condilar é mediolateral, ao contrário do que ocorre em humanos, que é principalmente anteroposterior. Comparativamente, a fossa e o processo condilar das ovelhas são muito semelhantes à ATM humana edêntula, sendo muito mais planos. Arquitetonicamente, o processo condilar em ambas as espécies também possui um córtex externo fino que envolve o osso medular, que é composto por osso trabecular. Há também uma fina camada de fibrocartilagem cobrindo a superfície condilar e toda a fossa mandibular, indicando partes da articulação temporomandibular que estão sujeitas à maior carga. A relação da ATM com o meato acústico externo, forame oval e a posição do disco articular que intercede entre o processo condilar e a fossa mandibular são semelhantes à anatomia da ATM humana. A morfologia do disco da ATM é muito semelhante ao disco da ATM humana. A escolha da ovelha como modelo animal para estudos da ATM tem sido utilizada por vários anos. Implantes de disco da ATM podem ser um complemento eficaz na reconstrução articular bioengenheirada e modelos animais podem oferecer a possibilidade de realizar estudos pré-clínicos informativos. Um dos problemas mais importantes para criar um TII eficaz é replicar as características biomecânicas do disco nativo. Portanto, informações sobre as propriedades biomecânicas do material substituto são indispensáveis para investigações futuras em engenharia de tecido do disco da ATM. Durante os movimentos mandibulares, o disco da ATM está sujeito a uma multiplicidade de diferentes regimes de carga. O disco da ATM se comporta como uma estrutura viscoelástica, atuando como um absorvedor de estresse e um distribuidor de estresse. Fibras elásticas desempenham um papel importante, fornecendo ao disco a estrutura viscoelástica necessária. Durante cada tipo de carga, o disco sofre uma deformação, enquanto forças internas são produzidas dentro do tecido. As forças internas são quantificadas pela quantidade de estresse, que é definida como força por unidade de área em Pa (1 Pa = 1 N/m2). Existem apenas dois estudos disponíveis sobre o disco da ATM bovina nos quais o módulo de tração e o módulo de compressão foram comparados usando o mesmo protocolo experimental e material. Nesses estudos, o módulo de tração variou entre 22 e 26 MPa, e o módulo de compressão entre 14 e 17 MPa. Dados sobre os discos da ATM suína, canina e humana estão disponíveis na literatura, mas os métodos utilizados para a obtenção e processamento do disco nem sempre são claros. Os módulos de tração relatados são aproximadamente 0,5—80 MPa, 20—25 MPa e 40—100 MPa, respectivamente, para os modelos animais mencionados acima. Para avaliar o comportamento mecânico dos discos da ATM de ovelhas, os autores relatam, pela primeira vez, como foi possível estimar, o módulo de tração anteroposterior e mediolateral e o módulo de compressão. O uso de discos da ATM frescos contribuiu para que os resultados fossem representativos da realidade. Os movimentos mandibulares das ovelhas são principalmente mediolaterais, explicando o melhor desempenho do disco da ATM suportando tensão na direção mediolateral. Em conclusão, as ovelhas parecem ser um excelente modelo experimental para estudos da ATM, sendo uma espécie grande com muitas semelhanças anatômicas com a estrutura humana em relação à abordagem cirúrgica, tamanho das estruturas anatômicas, forma e posição do processo condilar. O disco da ATM parece ser muito semelhante ao disco da ATM humana em relação à morfologia, histologia e biomecânica. É propósito do autor que o presente trabalho ajude em pesquisas futuras no campo da oromaxilofacial realizadas em ovelhas como uma excelente alternativa a outras espécies animais experimentais mais convencionais, também mais adequadas para treinamento cirúrgico procedimental.

D.F. Angelo, P. Morouço, N. Alves, T. Viana, F. Santos, R. González, F. Monje, D. Macias, B. Carrapiço, R. Sousa, S. Cavaco-Gonçalves, F. Salvado, C. Peleteiro, M. Pinho

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